論文：青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株的構(gòu)建及其防效評價模型分析

青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株的構(gòu)建及其防效評價模型分析

鄭雪芳1,2,劉波2(,林乃銓1(,朱育菁2,車建美2 (1福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院 福州 350002; 2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所 福州 350003)

摘要:
利用青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)無致病力菌株防治番茄青枯病具有很好的應(yīng)用潛力.作者通過分離篩選自然弱毒株、60Co輻射誘變和EZ-Tn5插入誘變,共構(gòu)建青枯雷爾氏菌無致病力突變體55株.其中,從番茄青枯發(fā)病植株分離到3株、從60Co輻射誘變獲得12株、從EZ-Tn5插入誘變獲得40株.經(jīng)盆栽番茄苗致病性檢測,15d后均未發(fā)病,證實均為無致病力青枯雷爾氏菌.進一步對番茄青枯病的防治試驗表明,從番茄青枯病發(fā)病田塊分離的無致病力突變株突變菌株FJAT-1458的防治效果最好,防效達100%.該菌株能定殖番茄植株根系土壤、根部和莖部,定殖數(shù)量均表現(xiàn)為"先增后減"的趨勢,并且接種濃度越大、苗齡越小,定殖數(shù)量越大.從構(gòu)建的防效模型可以看出,不同接種濃度條件下,植株發(fā)病率隨時間變化符合的回歸方程不同,相關(guān)系數(shù)R值也不同,接種濃度越大,R值越小.本研究獲得的青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株FJAT1458對番茄青枯病具有很好的防病效果.
關(guān)鍵詞:番茄青枯病;青枯雷爾氏菌;無致病力突變株突變菌株;定殖;生物防治

Construction of avirulent mutants of Ralstonia solanacearum against tomato bacterial wilt disease and analysis of its control efficacy Zheng *uefang1,2, Liu Bo2, Lin Neiquan1, Zhang Wenzhou2, Zhu Yujing2, Lin Kangmei2, Che Jianmei2 (1College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2Agricultural Bio-Resources Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China) Abstract: Avirulent Ralstonia solanacearum has a strong potential function in control tomato bacterial wilt disease. This study constructed avir
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wilt; Ralstonia solanacearum; avriulent mutant; colonization; biocontrol

青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)通常引起番茄青枯病[1-3],由于該菌在土壤中存活時間長、傳播快,尚未得到有效防治[4,5].青枯雷爾氏菌存在致病力分化,其弱/無致病力菌株進入植株,能在選擇的環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)中存活、定植,對寄主不致病,不對寄主起系統(tǒng)毒性和免疫敏感性,能較長時期存于寄主組織,利用生態(tài)位競爭和營養(yǎng)競爭阻止或延遲致病菌的侵入,從而防止或延遲植株發(fā)病[6,7].因此,利用青枯雷爾氏菌的弱/無致病力菌株防治作物青枯病具有一定生防潛力.許多研究表明,青枯雷爾氏菌無致病力菌株能在一定程度上控制青枯病的發(fā)展.楊宇紅等(2008),利用基因工程法獲得的無致病力hrp-突變體防治茄科蔬菜青枯病羅寬等(1983)用60Co輻射和紫外誘變獲得青枯雷爾氏菌無致病力突變株防治番茄青枯病,取,取得了一定良好的防病效果[8];陳慶河等(2003)利用紫外誘變法獲得青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株處理番茄,發(fā)現(xiàn)了番茄對青枯病原抗性,且無致病力突變菌株可在番茄體內(nèi)定殖和繁殖[9];董春等(1999)用自發(fā)突變的無致病力產(chǎn)細菌素菌株防治番茄青枯病取得一定的防治效果[10];Trigalet和Demery(1986)采用轉(zhuǎn)座子Tn5插入誘變均獲得青枯雷爾氏菌無致病力突變株,對番茄青枯病表現(xiàn)出良好的防效[11];Frey等(1993)通過對青枯致病菌的致病基因簇中某些片斷缺失的方法產(chǎn)生無致病突變體,在溫室內(nèi)對番茄青枯病具有較好此外,劉波等[7]、肖田等[10]、Trigalet和Demery[11]及Frey等[12]分別通過生防菌致弱、自然篩選、轉(zhuǎn)座子Tn5插入誘變、基因工程等途徑獲得青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株防治青枯病,均取得較好的防治效果.的防治效果[12].盡管前人在青枯雷爾氏菌無致病力突變株研究上做過一些研究,但是目前,構(gòu)建青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株的篩選模型、寄主體內(nèi)的定殖模型、對青枯病防效評價模型等研究未見報道. 本研究目的是通過構(gòu)建青枯雷爾氏菌無致病力突變體庫,從中篩選出防效好、性狀穩(wěn)定的青枯雷爾氏菌無致病力突變株用于防治番茄青枯病.本研究綜合采用分離篩選自然弱毒株、60Co輻射誘變致弱和EZ-Tn5插入誘變致弱來構(gòu)建青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株,從中篩選到一株出防效防效最好、性狀穩(wěn)定的菌株,研究該菌株的定殖的特性,構(gòu)建其對番茄青枯病防效評價模型,為番茄青枯病的有效控制奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料 致病性菌株青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)菌株FJAT91分離自番茄青枯病株,由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫收集并保存.供試的番茄品種為金石王1號,購自廈門如意集團開發(fā)有限公司.采用培養(yǎng)基TTC培養(yǎng)青枯雷爾氏菌[1313].轉(zhuǎn)座子試劑盒EZ-Tn5? Insertion Kit 購自美國EPICENTR公司;Biospin 細菌基因組DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶PstⅠ、T4連接酶購自美國Promega公司;卡那霉素(Km)購自美國Sigma公司.青枯雷爾氏菌特異性檢測引物[14]:pehA#3: 5-CAGCAGAACCC GCGCCTGATCCAG-3,pehA#6: 5-ATCGGACT TGATGCG CAGGCCGTT-3由上海博尚有限公司合成;3000bp Marker購自上海英竣生物技術(shù)公司.

1.2 試驗方法

1.2.1青枯雷爾菌無致病力突變株突變菌株的構(gòu)建 (1)青枯雷爾氏菌自然弱毒株的分離 從福建建甌番茄青枯病發(fā)病田塊采集不同發(fā)病級別的植株,進行病原菌的分離.分具體分離方法參照劉波方等[15]的方法法如下.:各樣本沖洗干凈后吸去水分,稱取10 g,經(jīng)嚴格的表面消毒后,研磨成勻漿,用無菌水進行系列梯度稀釋,涂布于TTC平板上,30 ℃,培養(yǎng)48 h后,觀察菌落的形態(tài). (2)青枯雷爾氏菌轉(zhuǎn)座子EZ-Tn5? 插入致弱突變株突變菌株的構(gòu)建 以致病性青枯雷爾氏菌FJAT91作為出發(fā)菌株,將其活化于TSB平板上,挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中,170 r/min,30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,按照1%接種比例接入200 mL新鮮的10%TSB培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期,冰浴30 min,4 ℃,6 500 r/min離心15 min,去上清,無菌水漂洗4次,沉淀用1 mL無菌水懸浮.取1 μL Tn5 Transposomes與100 μL的感受態(tài)細胞混合,電擊條件為2.5 kv,25 μF和400 Ω,電擊結(jié)束后,迅速加入900 μL10%TSB培養(yǎng)基,100 r/min,30 ℃培養(yǎng)后,涂布于含有50 μg/mL Km的10%TSB培養(yǎng)基上,30 ℃,培養(yǎng)48 h,觀察菌落形態(tài),根據(jù)菌落形態(tài)(無流動性,中間為暗紅色,白邊窄,表面干燥)挑取青枯雷爾菌無致病力突變株突變菌株,經(jīng)純化培養(yǎng)后,以終濃度為20%的甘油于?80 ℃保存. (3)青枯雷爾氏菌60Co輻射致弱突變株突變菌株的構(gòu)建 青枯雷爾氏菌FJAT91為出發(fā)菌株,菌株經(jīng)TTC平板活化后,接種于SPA液體培養(yǎng)基,170 r/min,30 ℃培養(yǎng)24 h后,8 000 r/min離心15 min,沉淀物用生理鹽水清洗2-3次,調(diào)整菌懸液細胞濃度為108 cfu/mLCFU/mL將菌懸液分別分置3支試管中,每管5 mL,直接進行60Co輻射處理,輻射劑量為0.5 kGy,輻射后經(jīng)系列梯度稀釋后,涂布TTC培養(yǎng)基,30 ℃,培養(yǎng)48 h,根據(jù)菌落形態(tài)挑取青枯雷爾菌無致病力突變株突變菌株,經(jīng)純化培養(yǎng)后,以終濃度為20%的甘油于?80 ℃保存. (4)青枯雷爾氏菌電鏡樣品制備 出發(fā)菌株FJAT91和青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株在TTC平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)青枯雷爾氏菌(出發(fā)菌株FJAT91和青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株)單細胞菌落,用注射器滴一滴清水在菌落上,用牙簽刮取菌落,吸取菌液置特制的銅網(wǎng)上,以便于菌體的吸附.用經(jīng)醋酸鈾進行染色和固定,待染色的樣品干燥后,裝樣于于JEM-100C*II/S透射電子顯微鏡上觀察菌體形態(tài)并拍照透射電子顯微鏡上觀察.. (5)青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株的番茄盆栽苗致病力檢測 將不同途徑獲得的55株青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株在TTC平板上活化后,接種于SPA培養(yǎng)基中,170 r/min,30 ℃培養(yǎng)48 h,菌液稀釋至108 cfu/mLCFU/mL,傷根接種于5-6葉齡的番茄盆栽苗上,菌株FJAT91做陽性對照(接種濃度108 cfu/mLCFU/mL),清水作為陰性對照,接種量為50 mL/盆,每個處理30盆,每天觀察植株發(fā)病率.

1.2.2 青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株的防病效果評價及其模型構(gòu)建 不同途徑獲得的青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株經(jīng)TTC平板活化后,接種于SPA培養(yǎng)基中,170 r/min,30 ℃培養(yǎng)48 h,菌液稀釋至108 cfu/mLCFU/mL,傷根預(yù)接種于5-6葉齡的番茄盆栽苗上,3 d后再接種致病性青枯雷爾氏菌FJAT91(接種濃度108 cfu/mLCFU/mL),單接種致病性青枯雷爾氏菌FJAT91做對照,接種量為50 mL/盆,每處理30盆,每天觀察番茄植株的發(fā)病情況,統(tǒng)計不同處理番茄植株的發(fā)病率,以青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株為樣本,番茄植株的發(fā)病率、病情指數(shù)及防效為指標構(gòu)建青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株的防效評價模型,從中.比較不同途徑獲得的青枯雷爾氏菌無致病力突變株對番茄青枯病的防效,篩選出防效好防效最好的菌株,進一步研究其定殖特性,并構(gòu)建其防效模型.

1.2.3 青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株FJAT1458的定殖特性 將菌株FJAT1458的培養(yǎng)液(含菌量109 CFU/mL)配制成108 CFU/mL、106 CFU/mL和104 CFU/mL共3個濃度,采用傷根接種法,接種番茄盆栽苗,以清水為對照.(1)不同接種濃度處理:接種5-6葉齡的番茄盆栽苗,50 mL/盆,每處理30盆.(2)不同苗齡接種處理:接種2-3葉齡和5-6葉齡的番茄盆栽苗,接種濃度106 CFU/mL,50 mL/盆,每處理30盆.(1)菌懸液的制備:將菌株FJAT1458活化于TTC平板上,30 ℃培養(yǎng)48 h,挑取單菌落接種于SPA液體培養(yǎng)基中,170 r/min,30 ℃培養(yǎng)48 h,經(jīng)血球計數(shù)板計算,確定菌液的濃度為109 cfu/mL,將菌液濃度依次稀釋到108 cfu/mL,106 cfu/mL和104 cfu/mL. (2)番茄植株的培養(yǎng):將購自的番茄苗從穴盤移栽到盛滿土的塑料小缽中(小缽直徑15 cm、高10cm),1株/盆,澆水、施肥、除草等按常規(guī)管理.選取長勢一致的壯苗用于菌株FJAT1458的定殖和防效試驗. (3)不同接種濃度處理:設(shè)不同的接種濃度:104 cfu/mL、106 cfu/mL和108 cfu/mL,清水作為對照,采用傷根接種法,接種5-6葉齡的番茄盆栽苗,50 mL/盆,每處理30盆. (4)不同苗齡接種處理:分別設(shè)2-3葉齡和5-6葉齡的番茄盆栽苗接種,采用傷根接種法,接種濃度106 cfu/mL,以清水作為對照CK,50 mL/盆,每處理30盆. (5)取樣和回收分離方法:番茄盆栽苗經(jīng)不同接種方式處理后于接種后3、6、9、12、15、18、21、24 d取樣分析,每個處理隨機選取3株番茄植株,取其根系土壤、根及莖中部,采用TTC培養(yǎng)基分離目標菌株,根系 ……（未完，全文共29181字，當前僅顯示5248字，請閱讀下面提示信息。收藏《論文：青枯雷爾氏菌無致病力突變株突變菌株的構(gòu)建及其防效評價模型分析》）