論文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

論文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化
曾慶才1,2,肖榮鳳2,劉波2*,胡桂萍2

福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建 福州 350108;2.

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所,福建 福州 350003)

摘要:

利用響應(yīng)面方法研究生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵的培養(yǎng)基,探索疏松值、無(wú)機(jī)碳源、無(wú)機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)孢量的影響.單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:哈茨木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基的主成份、疏松值、最適無(wú)機(jī)碳源、最適無(wú)機(jī)氮源分別為微生物養(yǎng)豬墊料:麩皮=9:1、麥粒40%、蔗糖3%、硫酸銨2%.響應(yīng)面分析結(jié)果表明:麥粒、蔗糖、硫酸銨對(duì)哈茨木霉產(chǎn)孢量有顯著相關(guān)性,通過(guò)求解回歸方程可得:當(dāng)麥粒含量36.72%,蔗糖含量3.08%,硫酸銨含量1.74%時(shí),孢子產(chǎn)量可達(dá)2.80*1010個(gè)/g.

關(guān)鍵詞:哈茨木霉 固體發(fā)酵 培養(yǎng)基 產(chǎn)孢量 響應(yīng)面分析法

中圖分類(lèi)號(hào) Optimization of solid-state fermentation culture medium for the biocontrol strain of Trichoderma harzianum FJAT-9040 by response surface methodology. Abstract: Response surface methodology was used to optimize solid-state fermentation culture medium of Trichoderma harzianum FJAT-9
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劉愛(ài)榮等,2010;管懷驥等,2011;姚 彬等,2009);對(duì)黃瓜、花生和茄子等多種作物促進(jìn)生長(zhǎng)的作用(楊春林等,2008;王獻(xiàn)慧等,2012;胡 潔等,2012);誘導(dǎo)水稻等抗病性(Nzojiyobiri jean Berchmans等,2003)等等. 木霉菌要有良好的防治效果,生產(chǎn)發(fā)酵是關(guān)鍵.目前,生產(chǎn)上木霉的應(yīng)用多有孢子菌劑,雖然不少學(xué)者對(duì)其代謝產(chǎn)物在生防作用上進(jìn)行了研究(李 杰等,2011;王紅梅等,2010;郭培磊等,2009),但是由于代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性,增加樣品處理的難度,使實(shí)驗(yàn)操作工作量大,大大增加了生產(chǎn)成本,最終未能很好地在工業(yè)上應(yīng)用.通過(guò)發(fā)酵方式(液體發(fā)酵或固體發(fā)酵)可以獲得更多的孢子量.由于液體發(fā)酵所需設(shè)備相對(duì)復(fù)雜,發(fā)酵產(chǎn)物濃度不高,生產(chǎn)成本高(葛 龍等,2010),而固體發(fā)酵具有培養(yǎng)基來(lái)源豐富,價(jià)格低廉,操作簡(jiǎn)單,孢子質(zhì)量好等一系列優(yōu)勢(shì)被公認(rèn)為是獲得真菌孢子的最好方法之一(敖新宇等,2012).固體發(fā)酵的培養(yǎng)基可以是稻草、麩皮、秸桿等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物,近年來(lái)興起地微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)帶來(lái)了新的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物——微生物養(yǎng)豬墊料.它是通過(guò)微生物將谷殼,鋸末等發(fā)酵床原料及豬的糞尿的混合物中的有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行分解發(fā)酵,使墊料中含有豐富的養(yǎng)料(藍(lán)江林等,2012).若將其作為固體發(fā)酵的培養(yǎng)基,能為菌株提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),不但可以獲得大量的生防因子,還可以處理一些農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物,提高資源的利用價(jià)值,實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展.目前,仍較少見(jiàn)以微生物養(yǎng)豬墊料作為微生物固體發(fā)酵主要基質(zhì)的報(bào)道. 微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法很多,如單因素實(shí)驗(yàn)法、正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法、響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法等(肖懷秋等,2010),其中響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)以試驗(yàn)次數(shù)少,周期短等優(yōu)勢(shì)受到廣泛應(yīng)用(郝學(xué)財(cái)?shù)?2006).響應(yīng)面分析法是通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),獲得一定數(shù)據(jù)來(lái)擬合一個(gè)響應(yīng)面,從而摸擬出真實(shí)的極限條件下的曲面,并進(jìn)行可靠性地分析(張秀霞等,2012).響應(yīng)面分析法可以對(duì)一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及其交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響進(jìn)行分析,通過(guò)之間的關(guān)系在響應(yīng)面上獲得最佳點(diǎn),在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)分析上具有更多優(yōu)勢(shì)(張秀霞等,2012). 本研究以微生物養(yǎng)豬墊料作為哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵的主要培養(yǎng)基,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面法進(jìn)行哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化,篩選出哈茨木霉FJAT-9040最適產(chǎn)孢的固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方,旨在進(jìn)一步提高哈茨木霉FJAT-9040的產(chǎn)孢量和農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的利用率,為含哈茨木霉的生物菌肥和制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 供試菌種 哈茨木霉FJAT-9040,本研究所微生物菌種保存中心保存.

1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,蒸餾水 1 L,pH 自然. 固體發(fā)酵培養(yǎng)基 微生物發(fā)酵一年墊料、麩皮、麥粒、碳源、氮源、自來(lái)水等按適合比例混合

1.3 方法

1.3..1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基主要成份墊料與麩皮配比的篩選 主要成份墊料與麩皮按體積比為10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,0:10等配制7種培養(yǎng)基,每處理重復(fù)3次.組培瓶中裝50 ml培養(yǎng)基,初始含水量40%,封口膜封口,121 ℃,滅菌30 min,冷卻后,接入哈茨木霉FJAT-9040孢子懸浮液(1.0*107個(gè)/ ml),初設(shè)接種量為5%,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d.待發(fā)酵結(jié)束后,取5 g固體發(fā)酵物于45 ml無(wú)菌水中,用磁力攪拌器攪拌均勻,并將其稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后,吸取100 ul,于PDA平板上涂布均勻,28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d,記錄平板上的孢子數(shù).孢子數(shù)/g=同一稀釋度平均孢子數(shù)*10*稀釋倍數(shù)/5.篩選出最佳的主要成份配方.

1.3..2 培養(yǎng)基中麥粒含量對(duì)哈茨木霉FJAT-9040產(chǎn)孢量的影響 往1.3.1中篩選出的培養(yǎng)基中添加浸泡過(guò)夜的麥粒,按體積比為10%、20%、30%、40%、50%進(jìn)行添加,每處理重復(fù)3次.以下處理方法同1.3.1.篩選出最佳的疏松值含量.

1.3..3培養(yǎng)基中碳源對(duì)哈茨木霉FJAT-9040產(chǎn)孢量的影響 往1.3.1中篩選出的培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、蔗糖、乳糖,每處理重復(fù)3次.以下處理方法同1.3.1.篩選出最佳的無(wú)機(jī)碳源及最適濃度.

1.3..4培養(yǎng)基中氮源對(duì)哈茨木霉FJAT-9040產(chǎn)孢量的影響 往1.3.1中篩選出的培養(yǎng)基中添加硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉,每處理重復(fù)3次.以下處理方法同1.3.1.篩選出最佳的無(wú)機(jī)氮源及最適濃度.

1.3..5響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素篩選實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Bo*-Benhnken設(shè)計(jì)原理,采用軟件Design e*pert8.0進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面的分析實(shí)驗(yàn),以孢子數(shù)為響應(yīng)量,確定各因素對(duì)哈茨木霉FJAT-9040產(chǎn)孢量影響的顯著性和各組分的最佳組合.根據(jù)Bo*-Benhnken設(shè)計(jì)原理,響應(yīng)因子Y為哈茨木霉FJAT-9040的產(chǎn)孢量,麥粒(*1)、蔗糖(*2)和硫酸銨(*3)為三因素,因素三水平分為:-1、0和1、試驗(yàn)設(shè)計(jì)具體見(jiàn)表1. 表1培養(yǎng)基Bo*-Behnken因素水平表 Table1 The table of Bo*-Behnken factors 變量 代碼 編碼水平 未編碼 編碼 -1 0 1 麥粒 *1 A 30% 40% 50% 蔗糖 *2 B 1.0 g 1.5 g 2.0 g 硫酸銨 *3 C 0.5 g 1.0 g 1.5g 1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)E*CEL數(shù)據(jù)處理,響應(yīng)面分析法利用Design-e*pert 8.0軟件采用Bo*-Benhnken設(shè)計(jì)方法,對(duì)培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化. 2 結(jié)果與分析 2.1 固 ……（未完，全文共12960字，當(dāng)前僅顯示3083字，請(qǐng)閱讀下面提示信息。收藏《論文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化》）