畢業(yè)開題報(bào)告：p53與hssb1蛋白的分離純化與相互作用的研究

大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))開題報(bào)告
學(xué)院：化工學(xué)院　　　　　　　　 　專業(yè)班級：2008級生物工程一班　

課題名稱 p53與hssb1蛋白的分離純化與相互作用的研究

1、本課題的的研究目的和意義：
目的：通過分子克隆的方法分別表達(dá)帶有sumo標(biāo)簽的p53和hssb1（人類DNA單鏈結(jié)合蛋白）蛋白，經(jīng)過鎳親和柱，F(xiàn)PLC(快速蛋白液相色譜)中的分子篩和離子交換層析分離純化目的蛋白，將分離的兩種蛋白等量混合分別用ITC（等溫滴定量熱法），和分子篩，通過觀察出峰情況分析兩種蛋白的相互作用。
意義：Hssb1調(diào)節(jié)多種DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和修復(fù)，近期發(fā)現(xiàn)它對妊娠期胎兒呼吸以及骨骼生長有著重要作用，也有發(fā)現(xiàn)Hssb1與抑癌基因P53有相互作用，這對進(jìn)一步研究癌癥提供了線索，本課題主要是運(yùn)用分子克隆以及蛋白質(zhì)分離純化的技術(shù)手段，提純Hssb1與P53蛋白，并運(yùn)用幾種方法分析兩種蛋白的相互作用，最終從機(jī)理上理解兩種蛋白的作用原理，為治療癌癥提供新的思路。
2、文獻(xiàn)綜述（國內(nèi)外研究情況及其發(fā)展）：
抑癌基因p53在維持基因穩(wěn)定和阻止腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)
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21基因表達(dá)的關(guān)鍵事件。
目前，對p53與hssb1相互作用的機(jī)理了解的還不夠清楚，本課題旨在分離純化兩種蛋白，通過分子篩和ITC研究兩種蛋白有無相互作用及相互作用的強(qiáng)度，課題后續(xù)工作為結(jié)晶分離出來的蛋白，通過核磁共振和*射線技術(shù)研究兩種蛋白相互作用的機(jī)理，為研究腫瘤的機(jī)理和腫瘤治療的機(jī)理提供新的思路。

3、本課題的主要研究內(nèi)容（提綱）和成果形式：
研究內(nèi)容：
3.1、制備出帶有標(biāo)簽的能夠表達(dá)目的蛋白的重組質(zhì)粒；
3.2、目的蛋白的分離純化；
3.3、目的蛋白的相互作用分析。
成果形式：
提交本科學(xué)士論文。
4、擬解決的關(guān)鍵問題：
通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化每一步的實(shí)驗(yàn)條件，分離純化出大量的目的蛋白，分析兩種蛋白的有無相互作用及作用機(jī)理。
5、研究思路、方法和步驟：
5.1重組p53，hssb1基因的制備及轉(zhuǎn)化表達(dá)
1）分別設(shè)計(jì)引物以兩種基因的全長基因?yàn)槟０鍼CR擴(kuò)增兩種基因的核心片段；
2）選擇合適的載體分別利用限制性內(nèi)切酶酶切特異性片段并將目的基因連入載體并轉(zhuǎn)化入top 10菌株（目的基因應(yīng)帶有sumo或GST融合標(biāo)簽），涂板，挑克隆后小搖擴(kuò)增質(zhì)粒；
3）提取質(zhì)粒，分別用PCR和雙酶切的方法驗(yàn)證質(zhì)粒正確性，正確的質(zhì)粒送測序，檢查有無突變；
4）將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株，通過小搖，大搖，誘導(dǎo)，表達(dá)目的蛋白。
5.2 目的蛋白的分離純化
1）收集菌體，用裂解液懸浮菌體，超聲或高壓破碎菌體，高速離心收集上清；
2）親和層析，將上清與ni—beads混合4度binding兩個(gè)小時(shí)，分別用低濃度咪唑清洗和高濃度咪唑洗脫；
3）FPLC(快速蛋白液相色譜)進(jìn)行分子篩和離子交換層析分離春花目的蛋白，并跑膠驗(yàn)證。
5.3 目的蛋白相互作用的研究
1）利用ITC測定兩種蛋白的相互作用，得到Km值；
2）兩種蛋白等量混合，跑分子篩，分析出峰情況分析相互作用；
3) 蛋白結(jié)晶，通過核磁共振和*射線研究兩種蛋白相互作用機(jī)理。
6、本課題的進(jìn)度安排：
2013.3.1—2013.3.15 成功制備出表達(dá)目的蛋白的重組質(zhì)粒；
2013.3.16—2013.4.15 成功分離純化目的蛋白，并完成相互作用的分析；
2013.4.16—2013.5.15 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，完善蛋白純化的最佳條件；
2013.4.1—2013.6.1 閱讀大量相關(guān)文獻(xiàn)，并撰寫論文。
7、參考文獻(xiàn)：
[1] Levine AJ, Hu W, Feng Z. The P53 pathway: what questions remain to be e*plored? Cell Death Differ 2006; 13:1027-1036.
[2] Vousden KH, Prives C. Blinded by the light: The growing comple*ity of p53. Cell 2009; 137:413-431.
[3] Vousden KH, Lu *. Live or let die: the cell’s response to p53. Nat Rev Cancer 2002; 2:594-604.
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[5] Bode AM, Dong Z. Post-translational modification of p53 in tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2004; 4:793-805.
[6] Dai C, Gu W. p53 post-translational modification: deregulated in tumorigenesis. Trends Mol Med 2010; 16:528-536.
[7] Brooks CL, Gu W. ……（未完，全文共4448字，當(dāng)前僅顯示2247字，請閱讀下面提示信息。收藏《畢業(yè)開題報(bào)告：p53與hssb1蛋白的分離純化與相互作用的研究》）