畢業(yè)開題報告：p53與hssb1蛋白的分離純化與相互作用的研究

大學本科畢業(yè)論文(設計)開題報告
學院：化工學院　　　　　　　　 　專業(yè)班級：2008級生物工程一班　

課題名稱 p53與hssb1蛋白的分離純化與相互作用的研究

1、本課題的的研究目的和意義：
目的：通過分子克隆的方法分別表達帶有sumo標簽的p53和hssb1（人類DNA單鏈結合蛋白）蛋白，經過鎳親和柱，F(xiàn)PLC(快速蛋白液相色譜)中的分子篩和離子交換層析分離純化目的蛋白，將分離的兩種蛋白等量混合分別用ITC（等溫滴定量熱法），和分子篩，通過觀察出峰情況分析兩種蛋白的相互作用。
意義：Hssb1調節(jié)多種DNA復制，轉錄和修復，近期發(fā)現(xiàn)它對妊娠期胎兒呼吸以及骨骼生長有著重要作用，也有發(fā)現(xiàn)Hssb1與抑癌基因P53有相互作用，這對進一步研究癌癥提供了線索，本課題主要是運用分子克隆以及蛋白質分離純化的技術手段，提純Hssb1與P53蛋白，并運用幾種方法分析兩種蛋白的相互作用，最終從機理上理解兩種蛋白的作用原理，為治療癌癥提供新的思路。
2、文獻綜述（國內外研究情況及其發(fā)展）：
抑癌基因p53在維持基因穩(wěn)定和阻止腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)
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21基因表達的關鍵事件。
目前，對p53與hssb1相互作用的機理了解的還不夠清楚，本課題旨在分離純化兩種蛋白，通過分子篩和ITC研究兩種蛋白有無相互作用及相互作用的強度，課題后續(xù)工作為結晶分離出來的蛋白，通過核磁共振和*射線技術研究兩種蛋白相互作用的機理，為研究腫瘤的機理和腫瘤治療的機理提供新的思路。

3、本課題的主要研究內容（提綱）和成果形式：
研究內容：
3.1、制備出帶有標簽的能夠表達目的蛋白的重組質粒；
3.2、目的蛋白的分離純化；
3.3、目的蛋白的相互作用分析。
成果形式：
提交本科學士論文。
4、擬解決的關鍵問題：
通過反復實驗優(yōu)化每一步的實驗條件，分離純化出大量的目的蛋白，分析兩種蛋白的有無相互作用及作用機理。
5、研究思路、方法和步驟：
5.1重組p53，hssb1基因的制備及轉化表達
1）分別設計引物以兩種基因的全長基因為模版PCR擴增兩種基因的核心片段；
2）選擇合適的載體分別利用限制性內切酶酶切特異性片段并將目的基因連入載體并轉化入top 10菌株（目的基因應帶有sumo或GST融合標簽），涂板，挑克隆后小搖擴增質粒；
3）提取質粒，分別用PCR和雙酶切的方法驗證質粒正確性，正確的質粒送測序，檢查有無突變；
4）將質粒轉化進入表達菌株，通過小搖，大搖，誘導，表達目的蛋白。
5.2 目的蛋白的分離純化
1）收集菌體，用裂解液懸浮菌體，超聲或高壓破碎菌體，高速離心收集上清；
2）親和層析，將上清與ni—beads混合4度binding兩個小時，分別用低濃度咪唑清洗和高濃度咪唑洗脫；
3）FPLC(快速蛋白液相色譜)進行分子篩和離子交換層析分離春花目的蛋白，并跑膠驗證。
5.3 目的蛋白相互作用的研究
1）利用ITC測定兩種蛋白的相互作用，得到Km值；
2）兩種蛋白等量混合，跑分子篩，分析出峰情況分析相互作用；
3) 蛋白結晶，通過核磁共振和*射線研究兩種蛋白相互作用機理。
6、本課題的進度安排：
2013.3.1—2013.3.15 成功制備出表達目的蛋白的重組質粒；
2013.3.16—2013.4.15 成功分離純化目的蛋白，并完成相互作用的分析；
2013.4.16—2013.5.15 重復實驗，完善蛋白純化的最佳條件；
2013.4.1—2013.6.1 閱讀大量相關文獻，并撰寫論文。
7、參考文獻：
[1] Levine AJ, Hu W, Feng Z. The P53 pathway: what questions remain to be e*plored? Cell Death Differ 2006; 13:1027-1036.
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[4] Riley T, Sontag E, Chen P, Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat Rev Mol Cell Biol 2008; 9:402-412.
[5] Bode AM, Dong Z. Post-translational modification of p53 in tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2004; 4:793-805.
[6] Dai C, Gu W. p53 post-translational modification: deregulated in tumorigenesis. Trends Mol Med 2010; 16:528-536.
[7] Brooks CL, Gu W. ……（未完，全文共4448字，當前僅顯示2247字，請閱讀下面提示信息。收藏《畢業(yè)開題報告：p53與hssb1蛋白的分離純化與相互作用的研究》）