論文開(kāi)題：阿魏酸酯酶在畢赤酵母中的表達(dá)

大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）開(kāi)題報(bào)告
學(xué)院：　 化工學(xué)院 　　專(zhuān)業(yè)班級(jí)：生物工程2班　

課題名稱(chēng) 阿魏酸酯酶在畢赤酵母中的表達(dá)

1、 本課題的的研究目的和意義：

阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，簡(jiǎn)稱(chēng)FAE)又稱(chēng)肉桂酸酯酶，是羧酸酯水解酶的一個(gè)亞類(lèi)，是一種胞外酶，能水解阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將FA游離出來(lái)的酶。其主要生物功能是水解多糖與FA連結(jié)的酯鍵。
在食品工業(yè)中，可利用阿魏酸酯酶打斷阿魏酸與細(xì)胞壁材料，如麩皮、秸稈中多糖的交聯(lián)，高效降解多糖并獲得反式阿魏酸，它是重要的功能性食品基料。在飼料工業(yè)中，可利用阿魏酸酯酶處理植物性的原材料，將阿魏酸從植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中游離出來(lái)，破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，木質(zhì)素、半纖維素及纖維素之間的連接被部分
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糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來(lái)。其主要生物功能是水解多糖與阿魏酸連結(jié)的酯鍵。
到目前為止，阿魏酸酯酶目的基因的克隆表達(dá)已有多位學(xué)者進(jìn)行了研究，并取得了較好的結(jié)果。張帥兵等[4] 通過(guò)提取菌種CIB 423.1的RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得阿魏酸酯酶的基因片斷，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并建立快速酶活檢測(cè)體系。Evangelos等[5] 克隆了F.o*ysporum中的阿魏酸酯酶基因FoFaeC-12213，并測(cè)定了其序列。Takuya等[6] 在A.oryzae里面克隆出2種不同類(lèi)別的阿魏酸酯酶AoFaeB和AoFaeC，通過(guò)對(duì)其序列分析以及底物特異性研究，其分別屬于B型和C型阿魏酸酯酶。另外Takuya等[6] 克隆表達(dá)的基因AoFaeB能在pH范圍3-11內(nèi)保持穩(wěn)定，且在pH<3的酸性環(huán)境下仍保持穩(wěn)定，酸穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)使其對(duì)于食品工業(yè)尤其是釀造業(yè)顯得尤為重要。Anthony等[7] 以菌種作受體菌，對(duì)重組faeB進(jìn)行同源高效表達(dá)，并根據(jù)其耐高溫性質(zhì)在制漿應(yīng)用上做了研究。Juan等[8] 通過(guò)序列信息比對(duì)，同源建模，分子對(duì)接等技術(shù)分析阿魏酸酯酶基因的空間結(jié)構(gòu)、催化模式以及酶-底物結(jié)合位點(diǎn)。
但是目前的研究，菌種生產(chǎn)的阿魏酸酯酶其酶活不足以滿(mǎn)足在食品、飼料等方面的需求，因此在分子水平上利用基因工程改良產(chǎn)酶菌種使其產(chǎn)高酶活阿魏酸酯酶成為本實(shí)驗(yàn)主要研究?jī)?nèi)容。
在本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選取類(lèi)彈性蛋白作為純化標(biāo)簽純化阿魏酸酯酶，所謂類(lèi)彈性蛋白（Elastin-like polypeptides，ELPs）是一種通過(guò)基因工程方法合成的多肽聚合物，其結(jié)構(gòu)由類(lèi)彈性蛋白的肽段單元重復(fù)串連組成。在一定濃度下具有特殊的反向熱膠凝性質(zhì)。因其良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性，ELPs在醫(yī)藥、生物和材料學(xué)領(lǐng)域中擁有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，展示了廣泛的應(yīng)用前景。
目前，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)鮮有ELPs的研究報(bào)道，而國(guó)外則相對(duì)較深入。因此仍需對(duì)ELPs的非色譜純化方法進(jìn)行深入的研究與改進(jìn)。ELPs研究方面胡凡等[9]首次利用ELPs高效、廉價(jià)、操作簡(jiǎn)便等顯著優(yōu)點(diǎn)作為純化抗菌肽Hal18的純化標(biāo)簽，42℃，2 mol/L NaCl條件下，經(jīng)過(guò)二輪純化使產(chǎn)物的純度達(dá)到95%。解決了抗菌肽在表達(dá)過(guò)程中對(duì)宿主的毒害和表達(dá)產(chǎn)物易分解的問(wèn)題，同時(shí)也解決了因純化方法煩瑣導(dǎo)致的蛋白活性降低、裂解后融合標(biāo)簽蛋白不易去除等問(wèn)題。Doreen等[10] 利用ELPs溫度改變發(fā)生相變的性質(zhì)，低成本，更簡(jiǎn)單，快捷的純化出分支桿菌Ag85B/ESAT-6免疫原，生產(chǎn)出治療結(jié)核病更安全，價(jià)格低廉的抗體。Fong BA等人[11] 利用ELPs－內(nèi)含肽作為標(biāo)簽,純化出E.coli的RNA聚合酶(RNAP)。
酵母菌是一種單細(xì)胞的低等真核生物。相較于原核生物，它能夠識(shí)別真核基因幫助其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾，并將蛋白分泌至胞外。酵母菌由于安全可靠，培養(yǎng)周期短，生長(zhǎng)迅速，操作簡(jiǎn)單，又能彌補(bǔ)原核表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)真核基因方面的不足，因此成為最普遍的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。酵母表達(dá)系統(tǒng)中釀酒酵母和畢赤酵母是最常用的2種酵母表達(dá)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)以畢赤酵母作為載體，對(duì)重組菌進(jìn)行研究。
當(dāng)前分子水平上有關(guān)阿魏酸酯酶基因重組與改良的文章尚未 ……（未完，全文共5018字，當(dāng)前僅顯示1762字，請(qǐng)閱讀下面提示信息。收藏《論文開(kāi)題：阿魏酸酯酶在畢赤酵母中的表達(dá)》）