畢業(yè)論文：米曲霉G6PDH基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究

題目：米曲霉G6PDH基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究
院 （系） 化工學(xué)院
專 業(yè) 生物工程
屆 別 2012屆


米曲霉G6PDH基因在大腸桿菌中的表達(dá)
及其酶學(xué)性質(zhì)研究
摘 要
戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway, PPP）是生物體糖代謝的重要途徑之一，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH, EC 1.1.1.49）是PPP途徑最關(guān)鍵的氧化還原酶之一，它催化的反應(yīng)伴隨著還原力NADPH和6-磷酸葡萄糖酸-δ-內(nèi)脂的生成，參與氨基酸、脂類及核苷酸等細(xì)胞組成物質(zhì)的合成代謝，對細(xì)胞正常生長和代謝有重要影響。同時(shí)，G6PDH表達(dá)水平調(diào)控著葡萄糖糖酵解途徑轉(zhuǎn)向PPP途徑的代謝流進(jìn)而影響胞內(nèi)NADPH的濃度。
本論文成功表達(dá)了來源于米曲霉的G6PDH基因（gsd），并對經(jīng)表達(dá)、純化后的酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，為今后米曲霉PPP途徑代謝調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
以米曲霉CICC2012為實(shí)驗(yàn)菌株，提取米曲霉總RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）得到菌株的全長cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)NCBI上報(bào)道的gsd的mRNA序列，設(shè)計(jì)引物，采用融合PCR技術(shù)，擴(kuò)增出gsd的cDNA片段，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-cDNA-gsd，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli BL21(DE3)，成功誘導(dǎo)大腸桿菌過量表達(dá)gsd。序列測定和結(jié)果分析表明，gsd基因序列大小為1888 bp，含有355 bp內(nèi)含子，開放閱讀框長度為1533bp，編碼510個(gè)氨基酸，蛋白亞基分子量約為59 kDa。
大腸桿菌表達(dá)的G6PDH，經(jīng)Ni2+柱純化得到電泳級純化蛋白，G6PDH酶活性與大腸桿菌粗酶液相比，由12.94 U/mg提高到73.6 U/mg，G6PDH純化倍數(shù)為5.69，純化的回收率為56.3%。
工程菌表達(dá)純化后G6PDH的最適反應(yīng)pH為7.5，最適反應(yīng)溫度分別為40℃，Mg2+、Ca2+和Mn2+對G6PDH酶活力具有促進(jìn)作用，Co2+、Cd2+、Hg2+ 和Zn2+對其酶活力具有強(qiáng)烈的抑制作用。

關(guān)鍵詞：米曲霉；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；表達(dá)與純化









Gene e*pression in Escherichia coli and enzymatic properties of G6PDH from Aspergillus oryzae
Abstract
Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH, EC 1.1.1.49) is one of the key enzymes of pentose phosphate pathway, which generates reducing power NADPH and 6-phosphate gluconic acid-δ-fat, involved in the anabolic of amino acids, lips and nucleotides, plays an important role in normal cell growth and metabolism. The e*pression level of G6PDH regulates the metabolic flu* of glucose glycolytic pathway turn to the PPP pathway, thereby affecting the concenctration of intracellular NADPH.
In this paper, G6PDH gene (ecoded by gsd) were e*pressed and purifiedfrom Aspergillus oryzae. The purified enzymes were also characteriazed. The research will lay the basis for the metabolic regulation of PPP from Aspergillus oryzae. The main findings were as follows:
The totoal RNA of Aspergillus oryzae was e*tracted and the full length cDNA of A.oryzae CICC2012 was got by RT-PCR. According to the amino acid sequence of gsd reported on NCBI, the primers were desgined. The cDNA-gsd was amplified by fusion PCR technology using cDNA of Aspergillus oryzae CICC2012 as the template. The amplified cDNA-gsd were then connected with pET-32a(+) to construct the recombinant vector pET-32a-cDNA-gsd, then successfully induced the over-e*pression o
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糖和4-磷酸赤蘚糖）和還原力NADPH的含量，前者是生物重要的合成原料，后者則是許多生物合成反應(yīng)的專一性電子供體，可通過細(xì)胞色素系統(tǒng)或轉(zhuǎn)氫酶系統(tǒng)重新產(chǎn)生ATP，確保植物及時(shí)利用ATP釋放的能量，參與合成與抗凍性發(fā)育有關(guān)的蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，從而增強(qiáng)植株對低溫的適應(yīng)性，有助于幼苗抗凍性的提高。
隨著基因工程和代謝工程的發(fā)展，近幾年對G6PDH的研究由植物領(lǐng)域逐漸轉(zhuǎn)向微生物領(lǐng)域。Cécile等[8]構(gòu)建了G6PDH基因缺失的大腸桿菌工程菌，通過同位素通量分布技術(shù)分析基因修改后大腸桿菌中心碳代謝的碳代謝流，并將其與G6PDH基因過量表達(dá)工程菌和野生菌株進(jìn)行對比，以期確定特定的基因修改對離體狀態(tài)下大腸桿菌中心碳代謝流的影響，結(jié)果表明代謝流不但通過G6PDH酶活性的生化調(diào)控受到嚴(yán)格控制，而且也與PPP途徑中G6PDH的下游反應(yīng)間接相關(guān)。Hua等[9]研究了在葡萄糖限制培養(yǎng)和氮限制培養(yǎng)條件下的大腸桿菌葡萄糖磷酸異構(gòu)酶基因和G6PDH基因缺失對中心碳代謝流的影響，敲除葡萄糖磷酸異構(gòu)酶基因后PPP途徑成為葡萄糖代謝的主要途徑，在葡萄糖限制培養(yǎng)條件下G6PDH基因缺失對中心碳代謝沒有產(chǎn)生明顯的影響，而在氨限制培養(yǎng)條件下，葡萄糖磷酸異構(gòu)酶基因和G6PDH基因的突變引起了大范圍的溢出代謝，三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）的代謝流通量顯著下降，研究還發(fā)現(xiàn)氨限制培養(yǎng)條件下，G6PDH基因在PPP途徑代謝生成NADPH過程發(fā)揮著重要的作用。Chen等[10]對大腸桿菌進(jìn)行基因工程改造，獲得芳香途徑的代謝中間物，代謝通量分析發(fā)現(xiàn)G6PDH基因是碳代謝流改造的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，該研究為今后更有效的操作以改變大腸桿菌生理特征奠定了基礎(chǔ)。
G6PDH在真菌中也有廣泛研究，但在曲霉中的研究相對較少，特別是在米曲霉中更少有報(bào)道。Scott[11]從Neurospora crassa中分離純化了G6PDH蛋白，并對其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析，研究結(jié)果表明，G6PDH是一個(gè)二聚體蛋白質(zhì)，以葡萄糖-6-磷酸為底物時(shí)Km為0.037mM，NADP+為輔酶時(shí)Km為0.012 mM，最適pH和溫度分別為7.4和25℃。Kato等[12]首次分離純化了分離純化了念珠菌的G6PDH蛋白，研究發(fā)現(xiàn)ATP、GTP、甘油醛-3-磷酸、NADPH均對G6PDH蛋白的活性產(chǎn)生抑制作用，最適pH為8，最適溫度為55℃。曲霉中關(guān)于G6PDH的研究，目前還僅限于通過離子交換層析和親和層析的方法分離和純化G6PDH，做初步的酶學(xué)性質(zhì)分析。Niehaus等[13]通過親和層析分離純化了寄生曲霉中的G6PDH，研究發(fā)現(xiàn)Cd2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等金屬離子都不同程度抑制了G6PDH的酶活性，其中Zn2+對其活性具有強(qiáng)烈抑制作用，酶最適合pH為7.4，最適溫度為30℃。Ibraheem等[14]分離并純化了棘孢曲霉中的G6PDH，Co2+、Zn2+、NADPH、6-磷酸果糖都抑制了酶活性，且特異性地以NADP+為輔酶，當(dāng)以NAD+為輔酶時(shí)，沒有活性。Lambert等[15]通過親和離子交換層析的方法純化了黑曲霉和構(gòu)巢曲霉的G6PDH，并對這兩種曲霉的G6PDH分別進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，
1.4融合PCR技術(shù)
融合PCR技術(shù)（fusion PCR）采用具有互補(bǔ)末端的引物，形成具有重疊鏈的 PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意 DNA 片段連接起來。陳國梁等[16]認(rèn)為，此技術(shù)在不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理的條件下實(shí)現(xiàn) DNA片段的體外連接, 為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡捷的途徑。
隨著許多基因組測序計(jì)劃的完成及大量表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫（bEST）的建立，基因組研究已由結(jié)構(gòu)基因組逐漸轉(zhuǎn)向了功能基因組研究[17]。李敏等[18]利用同源重組技術(shù)手段，通過構(gòu)建突變或缺失的同源媒介基因載體并取代基因組中野生型的等位基因，從而探討目的基因與表型性狀間的關(guān)系，是研究動(dòng)物、植物、微生物基因功能的一種有效的遺傳操作方法。
同源重組的發(fā)生依賴于載體與目的片段間存在一定的同源片段，同源片段越長越有利于同源重組事件的發(fā)生[19]。傳統(tǒng)的同源重組載體的構(gòu)建是以限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶為基礎(chǔ)，通過一系列的酶切連接反應(yīng)將各片段逐步連接起來，方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不但在連接過程中引入了不必要的酶切位點(diǎn)堿基序列，而且在進(jìn)行長片段連接時(shí)，容易出現(xiàn)難以找到合適的酶切位點(diǎn)的問題。為了克服傳統(tǒng)的同源重組載體構(gòu)建方法的缺陷，劉亮偉等[20]對融合PCR技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)，加入自我延伸過程。研究表明自我延伸程序中的延伸時(shí)間是影響融合基因擴(kuò)增濃度的關(guān)鍵因素�，F(xiàn)有的融合PCR技術(shù)一般是通過兩個(gè)階段：第一階段先應(yīng)用特異性引物，對各片段進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，特異性引物的5c末端帶有一段相鄰片段的互補(bǔ)序列；第二階段在同一反應(yīng)體系中加入各片段的混合物，以一對外側(cè)引物進(jìn)行融合片段的全長擴(kuò)增。由于融合PCR技術(shù)正處于初步發(fā)展階段，在應(yīng)用過程中還存在很多問題，如融合產(chǎn)物長度一般在4.0 kb以下、待融合片段的個(gè)數(shù)一般不超過3個(gè)產(chǎn)物特異性差等。
1.5 研究內(nèi)容及意義
米曲霉（Aspergillus oryzae）是一種重要工業(yè)微生物，應(yīng)用于食品加工和發(fā)酵工業(yè)已有幾千年歷史。米曲霉是公認(rèn)的食品安全菌株，由于其發(fā)酵及后處理技術(shù)成熟的特點(diǎn)，被認(rèn)為是研究基因表達(dá)和蛋白質(zhì)分泌的理想對象。戊糖磷酸途徑是生物體糖代謝的重要途徑之一。G6PDH是PPP關(guān)鍵酶之一，G6PDH催化的反應(yīng)伴隨著還原力NADPH和戊糖的生成，參與氨基酸、脂類及核苷酸等細(xì)胞組成物質(zhì)的合成代謝，對細(xì)胞正常生長和代謝有重要影響。目前，對于G6PDH的研究主要集中在原核生物和動(dòng)植物中，真菌中文獻(xiàn)報(bào)道的菌種主要有黑曲霉、釀酒酵母。米曲霉是一類重要的工業(yè)微生物，關(guān)于米曲霉G6PDH基因（gsd）結(jié)構(gòu)和功能的研究鮮有報(bào)道，僅在NCBI上公布了gsd假設(shè)蛋白的基因信息。
本實(shí)驗(yàn)組通過在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)并純化G6PDH，并對G6PDH進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，為今后在戊糖磷酸途徑上改造米曲霉代謝流，使得代謝通量更多地流向目標(biāo)產(chǎn)物方向，為提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容主要包括：
（1）實(shí)驗(yàn)室通過對米曲霉的培養(yǎng)獲得菌株，提取其RNA，用逆轉(zhuǎn)錄PCR 法擴(kuò)增米曲霉cDNA基因；
（2）利用融合PCR，擴(kuò)增出cDNA-gsd，構(gòu)建pET-32a-gsd原核表達(dá)載體[21]，并對其進(jìn)行陽性克隆子鑒定及雙酶切驗(yàn)證并測序；
（3）重組大腸桿菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE法分析重組蛋白的表達(dá)水平；
（4）利用組氨酸標(biāo)簽純化G6PDH；
（5）對純化后的G6PDH進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。







第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法
2.1實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 主要儀器和設(shè)備
表2-1實(shí)驗(yàn)儀器
儀器 廠家
SW-CJ-IF單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司
DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司
Sorvall D-37520臺式冷凍離心機(jī) 德國KENDRD公司
ALC-210.2電子天平 上海精科天平有限公司
HYG-Ⅱ回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司
超純水儀 德國MILLIPORE公司
PCR儀DNA Engine BIO-RAD
DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠
GIS-2008凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司
抽濾機(jī) 天津津騰儀器有限公司
溫柔型混合儀 Thermo
奧立龍CHN800 pH計(jì) Thermo
BCD-222電腦溫控冰箱 德國西門子公司
*W-80A微型旋轉(zhuǎn)混合儀 上海滬西分析儀器廠
L*-100手掌離心機(jī) 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司
SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司
手提式壓力蒸氣滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司
ZHYW-100B型恒溫培養(yǎng)搖床 上海智城生化儀器公司
超聲細(xì)胞破碎儀JY92-Ⅱ 寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司
電泳儀EC250-90 Thermo

2.1.2 菌種和質(zhì)粒
Aspergillus oryzae CICC 2012：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，接種于葡萄糖-蛋白胨平板，¬-4℃保存，三個(gè)月傳代一次；
E. coli DH5α和E. coli BL21 (DE3)：實(shí)驗(yàn)室保存，10%甘油、-70℃保存，為轉(zhuǎn)化過程中的常見宿主菌；
pET-32a(+)多克隆載體：購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司；
2.1.3 主要酶和生物試劑
Taq DNA polymerase、Rnase A、dNTP、Taq Plus DNA polymerase、EZ Spin Column DNA Gel E*traction KIT、EZ Column Plasmid Mini-Preps Kit：上海生工生物工程技術(shù)有限公司；
所用限制性內(nèi)切酶、DNA marker：Takara（大連）有限公司；
RNAiso Plus：購自大連寶生物有限公司；
SDS-PAGE試劑盒：購自碧云天公司；
引物由上海生工合成，稀釋成25 mM的工作液使用；
Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒：購自北京康為世紀(jì)生物公司。
2.1.4 試劑溶液和培養(yǎng)基配方
2.1.4.1 試劑配方
500 mmol/L EDTA（pH 8.0）：在80 mL水中加入18.61 g乙二胺四乙酸二鈉，用NaOH（約2 g）調(diào)pH8.0，加水定容至100 mL。
1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）：80 mL水中加入12.11 g Tris，充分?jǐn)嚢枞芙�，用HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0，然后定容至100 mL。
TE緩沖液（pH 8.0）：取1 mL 500 mmol/L EDTA（pH 8.0），5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）加入燒杯中，用去離子水定容至500 mL即可，滅菌備用。
10% SDS（pH 7.2）：90 mL水中加入10 g電泳級十二烷基磺酸鈉（SDS），加熱至68℃助溶，用NaOH調(diào)pH 7.2，加水定容至100 mL。
10 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.0）：0.1 mol/L K2HPO4（約60 mL）與 0.1 mol/L KH2PO4（約40 mL）混合至pH為7.0，然后定容至1 L，滅菌備用。
10 mg/mL胰Rnase：將RNase溶于10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/mL的溶液，100℃加熱15 min，去除DNA酶活性，然后緩慢冷卻至室溫，分裝保存于-20℃。
20 mg/mL IPTG：溶解0.6 g IPTG于去離子水中，定容至25 mL。用0.22 μm過濾膜過濾除菌，小份分裝后，-20℃保存。
100 mg/mL氨芐青霉素：溶解2.5 g氨芐青霉素鈉鹽（Ampicillin）于去離子水中，定容至25 mL。用0.22 μm過濾膜過濾除菌，小份分裝后，-20℃保存。
20 mg/ml *-Gal：溶解0.5 g *-Gal于二甲基酰胺（DMF）中，定容至25 mL，小份分裝后，鋁箔封裹，-20℃避光保存。
電泳緩沖液（50*TAE）：取24.2 gTris-堿，加入5.71 mL冰醋酸和10 mL 0.5 mol/L EDTA，用蒸餾水定容至100 mL，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳使用的是1*TAE緩沖液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋50倍。
75%乙醇：取75 mL無水乙醇，溶于0.1%DEPC水中配制成100 mL，不需高壓除菌。按所需用量現(xiàn)配。
0.1 mol/L CaCl2：稱取1.11 g的無水CaCl2溶解于去離子水中，定容至100 mL，滅菌備用。
0.1%DEPC水：在1000 mL雙蒸水中加入DEPC原母液1 mL，然后攪拌至無油珠后靜置過夜，121oC滅菌。
SDS-PAGE所用溶液：
SDS-PAGE中使用的電泳緩沖液是1*Tris-甘氨酸，其貯存液為5*Tris-甘氨酸。5*Tris-甘氨酸緩沖液成份：0.125 mol/L Tris，1.25 mol/L甘氨酸，0.5%（W/V）SDS。
10%分離膠（per 10 mL）：dd H2O 2.7 mL，30%丙稀酰胺3.3 mL，1.5 mol/L Tris （pH 8.8）3.8 mL，10%（W/V）SDS 0.1 mL，10%過硫酸胺0.1 mL，TEMED 4 µL。其中30%丙稀酰胺成份（per L）：丙稀酰胺290 g，N, N’-亞甲雙丙稀酰胺10 g。
5％濃縮膠（per 3 mL）：dd H2O 2.1 mL，30%丙稀酰胺 0.5 mL，1.0 mol/L Tris （pH 6.8）0.38 mL，10%（W/V）SDS 0.03 mL，10%過硫酸胺0.03 mL，TEMED 3 µL。
考馬斯亮藍(lán)R-250染色液成份：0.1%（W/V）考馬斯亮藍(lán)R-250，40%（V/V）甲醇，10%（V/V）冰醋酸。
考馬斯亮藍(lán)染色脫色液成分：10%（V/V）冰醋酸，10%（V/V）甲醇。
2.1.4.2 葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基
表2-2 葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基配方(用于米曲霉培養(yǎng))
試劑 含量
葡萄糖(Glucose) 2.0%
多聚蛋白胨(Polypepton) 1.0%
KH2PO4 0.5 %
NaNO3 0.1 %
MgSO4•7H2O 0.1 %
pH6.0；
固體培養(yǎng)基添加瓊脂 1.5%
2.1.4.3 LB培養(yǎng)基
表2-3 LB培養(yǎng)基配方
試劑 含量
酵母提取物 0.5 %
NaCl 1.0%
胰蛋白胨 1.0 %
pH7.0；
固體培養(yǎng)基添加瓊脂 1.8%
需要時(shí)使用前加入氨芐青霉素使終濃度為100 μg/mL，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)。
2.1.4.4 SOC培養(yǎng)基
胰蛋白胨20.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KCl 2.5 mmol/L，MgCl2 10 mmol/L，葡萄糖20 mmol/L，pH7.0。
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 菌體的培養(yǎng)與收集
從4℃保藏的米曲霉菌體CICC2012斜面挑取米曲霉在葡萄糖-蛋白胨平板上劃線活化，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后從活化好的平板上挑取適量菌絲到100 mL 2% 葡萄糖-蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30℃恒溫?fù)u床中150 rpm培養(yǎng)3 d。無菌條件下，真空過濾收集菌體，用pH 7.0，10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，用玻棒與無菌濾紙盡量擠干菌體水分，使菌絲體呈“餅狀”。收集于50 mL離心管中，直接使用或置 -20℃冰箱保存待用。
2.2.2 米曲霉總RNA的提取
（1）采用石英砂研磨法，稱取0.5g新鮮菌體于無菌研缽中，加入適量石英砂研磨（0.1 g菌體-0.1 g石英砂），之后再加入過量的液氮將菌絲體覆蓋，之后迅速研磨成粉末狀，研磨時(shí)間控制在30 min，其間必須保證液氮覆蓋菌絲體，研磨過程中要不斷地添加液氮，（無明顯的顆粒，如果沒有研磨徹底，將會影響RNA的收率和質(zhì)量）至裂解液研磨完之后迅速集合粉末于研缽底部中央；
（2） 每50~100 mg普通樣品量迅速加入RNAiso Plus 1 mL抽提液將樣品粉末狀完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研椎繼續(xù)研磨至裂解液完全呈透明水狀；
（3）用DEPC處理過的大槍頭和EP管，把混合液分裝到已經(jīng)滅菌的EP管中，室溫靜置5 min，加入氯仿（RNAiso Plus 的1/5體積量），旋轉(zhuǎn)混合儀混合10 s，室溫靜置5 min；12000 rpm、4 ℃，離心5 min；
（4）加入與上清液等體積的異丙醇，室溫放置10 min，12000 rpm，4 ℃離心10 min，棄上清液；
（5）RNA沉淀的清洗。沉淀經(jīng)1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）洗滌后，緩慢輕柔上下顛倒混勻5次，免觸碰白色的沉淀；在操作臺上將EP管內(nèi)壁的水珠倒置于濾紙上，上下敲打EP管內(nèi)的水分，充分干燥管內(nèi)的乳白色沉淀物，室溫干燥5 min（為了更好得控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇）；
（6）RNA的溶解。室溫干燥沉淀2~5 min（不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解）。加入20~30 μL 0.1% DEPC水充分溶解白色沉淀物，必要時(shí)可以用移液槍輕輕吹打沉淀，待沉淀完全溶解后存于-80℃中，其余EP管放于-70℃冰箱中；
（7）0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取5μL +1μL 6*Loading Buffer作為凝膠電泳分析。
2.2.3 米曲霉總cDNA合成
（1）模板RNA[22]：
將提取的Total RNA或poly(A)+RNA 取0.1~0.5 μg；(按RNA濃度公式計(jì)算)，加入1 μL引物Oligo(dT)18(0.5 μg/μL) ，用DEPC水補(bǔ)足至12 μL；
（2）將上述反應(yīng)混合液裝入200 μL EP管中，瞬時(shí)離心混合3~5 s；
70 ℃溫浴 5 min，瞬時(shí)離心后冰浴30秒；
（3）在冰浴條件依次加入下列反應(yīng)混合物：
5*反應(yīng)混合液 4 μL；
RNase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL;
dNTP mi*(10 mmol/L) 2 μL;
瞬時(shí)離心；
（4）在37℃混合均勻5 min，之后加入：
MMULV反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL；
最后的總體積 20 μL.
（5）瞬時(shí)離心后37℃ 1 h，最后于70℃終止反應(yīng)，10 min后，反應(yīng)液置于冰浴條件下。
2.2.4 融合PCR擴(kuò)增cDNA-gsd
由于目的cDNA片段比較長，故采取兩步PCR，即融合PCR的方法。分別擴(kuò)增出具有重疊部分的兩條片段，兩條片段互為模板，最終拼接擴(kuò)增出目的基因片段。融合PCR技術(shù)采用的是具有互補(bǔ)末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物。通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意DNA片段連接起來。此技術(shù)在不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理的條件下實(shí)現(xiàn)DNA片段的體外連接，為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡捷的途徑。
（1）引物設(shè)計(jì)
參照NCBI數(shù)據(jù)庫中A.oryzae RIB40菌株的gsd（*P_001818354）基因序列，采用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)引物[23]，交由上海生工生物公司合成。
（2）引物信息
片段1上游引物1F：5′-CTACATTCCTTCCATCCCAC - 3′
片段1下游引物1R：5′-AACGTCACGAATGATACCAA - 3′
片段2上游引物2F：5′-GAACCGTCATCACATCGATAA - 3′
片段2下游引物2R：5′- ACTTTCGTTAGCCTCATAAGC - 3′
序列為擴(kuò)增片段的特異性引物序列
P1：5′- CAGACGGAT ……（未完，全文共57986字，當(dāng)前僅顯示10430字，請閱讀下面提示信息。收藏《畢業(yè)論文：米曲霉G6PDH基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究》）